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Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) Dissertation

EINLEITUNG 5Teshima et al. 1985; Yamazaki et al. 1985), Formiat-Dehydrogenase (Schauer et al. 1986), Methylentetrahydromethanopterin-Dehydrogenase

EINLEITUNG 6(Mer) (Ma & Thauer 1990b; Ma & Thauer 1990a; Ma & Thauer 1990c; te Brommelstroet et al. 1990; Ma et al. 1991) und F420-abh

EINLEITUNG 7Methanol, Methylaminen oder Alkoholen und CO2 unter Bildung von Methan (CH4) wachsen. Tabelle 1: Verwandtschaft einzelner Coenzym F420-

EINLEITUNG 8 Abbildung 2 zeigt eine Übersicht der F420-abhängigen Reduktions- und Oxidations-Reaktionen und der sie katalysierenden Enzyme im Stof

EINLEITUNG 9thermophilicus zu ermitteln, da dieses Enzym nach Reinigung F420 gebunden enthält und mit Mer sequenzverwandt ist. Zum anderen wurde ve

EINLEITUNG 10Weitere sekundäre Alkohole wie 2-Butanol und 2-Pentanol werden von Adf mit verminderter Geschwindigkeit oxidiert und Ketone, wie Aceto

EINLEITUNG 11 Abbildung 4: Reaktion der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer). F420, Coenzym F420; H4MPT, Tet

EINLEITUNG 12Tertiärstruktur der NADP-abhängigen Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF) aus Escherichia coli, obwohl beide Enzyme keine signifika

EINLEITUNG 13Relativ häufig kommen sie aber in Peptidbindungen vor, in welchen die Iminosäure Prolin beteiligt ist. Wie aus Statistiken hervorgeht,

MATERIAL UND METHODEN 14 III Material und Methoden 1. Material Chemikalien und Biochemikalien. Die Crystal-Screen-Kits 1 und 2 wurden von Hampt

Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden in der Zeit von Dezember 2001 bis August 2004 am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie

MATERIAL UND METHODEN 15Gase. Die verwendeten Gase N2 (99,993%), H2/CO2 (80%/20%), N2/CO2 (90%/20%) wurden von der Firma Messer-Griesheim (Düsseldo

MATERIAL UND METHODEN 16Medium 1 Komponente Menge Salzlösung Spurenelementlösung I Spurenelementlösung II

MATERIAL UND METHODEN 1711 Tage kultiviert. In dieser Zeit wurde verbrauchtes H2/CO2 täglich nachgeführt. Am 7. Inkubationstag wurden 3 ml 2-Propan

MATERIAL UND METHODEN 18einer OD578 von 4,5 – 5 wurden die Kulturen innerhalb von 20 min auf ca. 10 °C abgekühlt und anschließend mit Hilfe einer

MATERIAL UND METHODEN 19 Medium 3 Spurenelementlösung Komponente Menge Komponente Meng

MATERIAL UND METHODEN 20Aaerobenzelt in 5 ml Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 27000 x g (30 min) zentrifugiert, um noch intakte

MATERIAL UND METHODEN 21(3a) 40 mM Kaliumphosphat, pH 7; (4a) 50 mM Tris, pH 7,6; 400 mM (NH4)2SO4, 10 mM 2-Propanol; (5a) 50 mM Tris, pH 7,6; 400

MATERIAL UND METHODEN 22durch einen steigenden KCl-Gradienten (in 50 mM Tris/HCl, pH 7,6; 0 M bis 0,5 M in 200 ml) von der Säule gewaschen. Es wurd

MATERIAL UND METHODEN 23verschlossen und durch mehrmaliges Evakuieren und Begasen mit N2 (150 kPa) anaerobisiert. Die Testkomponenten wurden als an

MATERIAL UND METHODEN 24Flussrate wurde auf 1 ml/min eingestellt. Vom Eluat wurde durch ein in das Gerät integriertes Diodenarray-Photometer (S3210

Die in der Dissertation beschriebenen Ergebnisse wurden in folgenden Orginalpublikationen veröffentlicht: Aufhammer SW, Warkentin E, Berk H, Shima S

MATERIAL UND METHODEN 25mM Na-Citrat, pH 4) regelmäßig reproduziert und für die Aufnahme von nativen Datensätzen oder die Präperation von Schwerato

MATERIAL UND METHODEN 26Research, CA/USA) in eine Mikroschale mit Reservoirlösung transferiert. Dieser Lösung wurden die Schweratomverbindungen in

MATERIAL UND METHODEN 27Detektor-Abstand und der Oszillationswinkel gewählt. Da der Strahlungsschaden während der Aufnahmen am Kristall stark zunah

MATERIAL UND METHODEN 28Prozessierung des Datensatzes. Die Prozessierung eines einzigen Datensatzes war möglich. Die Datenauswertung erfolgte mit H

MATERIAL UND METHODEN 294.6 Modellbau und Modellverfeinerung Der graphische Modellbau erfolgte mit dem Programm O (Jones et al. 1991). Die Modell

ERGEBNISSE/PUBLIKATIONEN 30 V Ergebnisse/Publikationen Dieses Kapitel besteht aus zwei Publikationen, welche den Ergebnis-Teil der vorliegenden A

ERGEBNISSE/PUBLIKATIONEN 31Bildung des Addukts im aktiven Zentrum führt zu einer irreversiblen Bindung des Coenzyms F420 in der Alkohol-Dehydrogena

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Meinen Eltern gewidmet

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INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis I Zusammenfassung II Einleitung III Material und Methoden 1. Material 2. Kultivier

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DISKUSSION 53V Diskussion 1. Substratbindestelle und Katalysemechanismus von Adf und Mer Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase

DISKUSSION 54möglich, kommen statistisch aber seltener vor (Jabs et al. 1999). Die cis-Bindung in Adf und Mer wird durch eine benachbarte, elektros

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1Abkürzungsverzeichnis adf Gen der Coenzym F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase Adf Coenzym F420-abhängige Alkohol-

DISKUSSION 55Wasserstoffbrückenbindungen zwischen F420 und Hauptkettenatomen und die cis-Bindung in Adf und Mer von Seitenketten unabhängig ausbild

DISKUSSION 56Mit Hilfe des Aceton-Addukts ist es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase zu modellieren

DISKUSSION 57Ausrichtung des aktivierten H-Atoms am C2 auf das elektrophile C5 des Coenyms mit Hilfe beider angrenzenden `Methyl-Anker´ erklärt die

DISKUSSION 58Protons der Carboxylatgruppe von Glutamat 108 auf N10 des Deazaflavins möglich. Nach Ablauf der katalytischen Reaktion verlieren die a

DISKUSSION 59Position von Glutamin 183, Aspartat 120 und Glutamat 25 auf der Si-Seite von FAD in Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF), dem anal

DISKUSSION 60Der Vergleich der Kristallstrukturen von Reduktase Mer mit und ohne gebundenem Coenzym liefert weitere Argumente für die Rolle von Asp

DISKUSSION 61Unterschiede der Konformation der helicalen Segmente 7-1 bis 7-5 von Insertionsregion 3 wurde in allen Kristallstrukturen von Redukt

DISKUSSION 62sondern aktivierte Wassermoleküle koordiniert (Sage et al. 1996). In Mer ist Glutamat 6 nicht weit von N10 des modellierten Methylente

DISKUSSION 63einem Flavinderivat auf eine an einem Pterin-Ring gebundene C1-Gruppe katalysieren und eine ähnliche Tertiärstruktur teilen, kann die

DISKUSSION 64Mutagenese identifiziert, jedoch fehlen für ein Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung die Bindestellen des Coenzyms und des lan

ZUSAMMENFASSUNG 2I Zusammenfassung Coenzym F420 ist ein 5´-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und

DISKUSSION 65Um die Modellierung des Coenzyms zu ermöglichen, wurden zwei geringfügige konformationelle Änderungen in Seitenketten von Histidin 44

DISKUSSION 66Krümmung beteiligt sein, da der Austausch dieses Restes zu einer Verschiebung des Emissionsspektrums führt (Lin et al. 2004). Überrasc

DISKUSSION 673. Vergleich der F420-Bindestelle in Mer und Adf mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und in 8-HDF-Photolyase In der Aminosäuresequ

DISKUSSION 68 Abbildung 14: Wechselwirkungen von Coenzym F420 in Fno (Warkentin et al. 2001). Der Deazaflavin-Ring wird auf seiner Re-Seit

DISKUSSION 69benötigt. Des weiteren wird das Deazaflavin über polare Interaktionen der Ribitolgruppe mehrfach fixiert. Der Bindung von F0 in Phr is

DISKUSSION 70VI Literaturverzeichnis Abrahams JP, Leslie AGW (1996) Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F-1 ATPas

DISKUSSION 71Banner DW, Bloomer AC, Petsko GA, Phillips DC, Pogson CI, Wilson IA, Corran PH, Furth AJ, Milman JD, Offord RE, Priddle JD, Waley, SG

DISKUSSION 72Bleicher K, Winter J (1991) Purification and properties of F420- and NADP(+)-dependent alcohol dehydrogenases of Methanogenium liminat

DISKUSSION 73Davies DR, Segal DM (1971) Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzymol 22:266-269 De La Forte

DISKUSSION 74Eker AP, Kooiman P, Hessels JK, Yasui A (1990) DNA photoreactivating enzyme from the cyanobacterium Anacystis nidulans. J Biol Chem 26

ZUSAMMENFASSUNG 32-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert.

DISKUSSION 75Fisher AJ, Thompson TB, Thoden JB, Baldwin TO, Rayment I (1996) The 1.5-Å resolution crystal structure of bacterial luciferase in low

DISKUSSION 76Heiss G, Hofmann KW, Trachtmann N, Walters DM, Rouviere P, Knackmuss HJ (2002) npd gene functions of Rhodococcus (opacus) erythropolis

DISKUSSION 77Kiener A, Husain I, Sancar A, Walsh C (1989) Purification and properties of Methanobacterium thermoautotrophicum DNA photolyase. J Bio

DISKUSSION 78Kunow J, Schworer B, Setzke E, Thauer RK (1993a) Si-face stereospecificity at C5 of coenzyme F420 for F420-dependent N5,N10-methylenet

DISKUSSION 79Lin XL, White, RH (1986) Occurrence of coenzyme F420 and its gamma-monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal

DISKUSSION 80Merritt EA, Murphy MEP (1994) Raster3D Version 2.0 - A program for photorealistic molecular graphics. Acta Crystallogr A 50:869-873 M

DISKUSSION 81Sage CR, Rutenber EE, Stout TJ, Stroud RM (1996) An essential role for water in an enzyme reaction mechanism: the crystal structure of

DISKUSSION 82Shima S, Warkentin E, Grabarse W, Sordel M, Wicke M, Thauer RK, Ermler U (2000) Structure of coenzyme F420-dependent methylenetetra-h

DISKUSSION 83Theorell H, Chance B (1951) Studies on liver alcohol dehydrogenase II. The kinetics of the compound of horse liver alcohol dehydrogena

DISKUSSION 84Walsh C (1996) Naturally occurring 5-deazaflavin coenzymes: Biological redox roles. Acc Chem Res 19:216-221 Warkentin E, Mamat B, Sor

EINLEITUNG 4II Einleitung Coenzym F420 ist eine blaugrün-fluoreszierende Verbindung, die von Cheeseman et al. 1972 aus Methanobacterium bryantii S

DISKUSSION 85Yamazaki S, Tsai L, Stadtman TC, Jacobson FS, Walsh C (1980) Stereochemical studies of 8-hydroxy-5-deazaflavin-dependent NADP+ reducta

DISKUSSION 86Publikationsliste Smirnova A, Li H, Weingart H, Aufhammer S, Burse A, Finis K, Schenk A, Ullrich MS (2001) Thermoregulated expressio

DISKUSSION 87Lebenslauf Persönliche Daten Name: Stephan W. Aufhammer Geburtstag: 23.04.1975 Geburtsort: Bonn Familienstand: ledig S

DISKUSSION 88Dank Mein besonderer Dank gilt den Herren Professor Dr. Rudolf K. Thauer und Dr. Seigo Shima für die Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe, d

DISKUSSION 89Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich meine Dissertation mit dem Titel „Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrog